Mitocondrias - Radicales Libres – Apoptosis

por el Dr. Ricardo Carlos Gross

(especial para Fundacion Einstein)

Las especies reactivas al O2 (ROS) generadas por mitocondrias, son productos del metabolismo oxidativo normal. El destino de estas especies esta regido por un numero de factores que, en mamíferos, varían según el tejido y pueden estar envueltos en la patogenia de una determinada enfermedad.
Las ROS también están involucradas como agentes importantes en los procesos que activan la apoptosis celular.
La integración del conocimiento que rodea los diferentes aspectos de la generación de las ROS es difícil y revela intervalos en nuestro entendimiento.

INTRODUCCION

Hace 20 años se proponía que la longitud de la vida estaba relacionada, de alguna manera, con la eficacia de la disposición de Radicales Libres de O2 (RLO), generados en el curso de reacciones celulares oxidativas. (Harman 1981)
De este modo, ha sido pensado que la tasa de generación de estos RLO se relacionaría a la tasa promedio de metabolismo.
El proceso apoptótico es utilizado para remover células dañadas o no deseadas, en la mayoría de los organismos multicelulares. Los RLO poseen un rol, fuertemente involucrado como intermediario, en dicho proceso apoptótico.

GENERACION DE RLO POR LA MITOCONDRIA:

La molec. de O2 es capaz de aceptar un e- adicional para crear un Superoxido (O2-), una forma de O2 mas reactiva.

O2 + 1e- O2-

El O2- es el RLO primario producido por la mitocondria, y probablemente sea producto de mecanismos no enzimáticos.

La Ubiquinona generada en el curso de las reacciones transportadoras de e- de la cadena respiratoria, dona e- al O2 y provee una constante fuente de O2-.

Ub- + O2 O2- + Ub.
El O2- puede atacar centros de Sulfuro Ferroso (FeS) en enzimas como la Aconitasa, Succinato Dehidrogenasa y la NADH Ubiq. Oxidoreduc. mitocondrial, liberando Fe y destruyendo la función catalítica.
El O2- es por lo tanto, removido rápidamente por una conversión a Peróxido de Hidrogeno (H2O2) en una reacción catalizada por las Superóxido Dismutasa (CESPED o S.O.D).
Existen 3 tipos de SOD: una Citosólica que contiene Cu y Zn, denominada SOD-I; una mitocondrial con Mn llamada SOD-II; y otra extracelular con Cu y Zn nombrada SOD-III.
Una 2ª y mucho mas dañina especie, el radical Hidroxilo (OH), puede ser producto del H2O2 en presencia de iones cúpricos o férricos mediante la reacción FENTON, dañando a proteínas, lípidos y al ADN:

Fe++ + H2O2 --> Fe+++ + .OH + :OH-

Existe una ruta de formación alternativa, que puede involucrar la reacción del H2O2, para producir una reacción hidroxilativa en el sitio activo de las SOD que poseen Cu y Zn (citosólica y extracelular)
La mayoría del H2O2, generado por las SOD I y II, a ambos lados de la membrana mitocondrial, es procesado por la Glutation Peroxidasa para ser convertido en H2O.
La glutatión peroxidasa, cataliza la reducción de ácidos orgánicos y peroxido de hidrógeno, en reacciones que participa el Glutatión o GSH oxidandose. Esta enzima esta alojada en citosol y mitocondrias, pero no en peroxisomas.

H2O2 + 2GSH GSSG + 2 H2O

La produccion de O2- por la cadena respiratoria, significa menos del 1% de la tasa total de los e- transportados desde NADH + H hasta el O2.
Puesto que la variabilidad de la tasa del transporte de e- depende de la demanda energética, se han hecho varias estimaciones usando diferentes métodos.
La medición de la concentracion de O2- y el H2O2 (generado después de la conversion por SOD) sugiere fuertemente que la producción de ROS es mas alta en el estado 4 de respiración (ADP limitado) que en el estado 3 (respiracion activa).

La producción de O2- por la cadena respiratoria

La cadena respiratoria mitocondrial se compone por cuatro complejos transportadores de e-, y un complejo translocador de H+ con funcion ATPasa, que sería el complejo V. Dos de estos complejos son los responsables de la generación de la mayoria de los O2- producidos por la mitocondria: el complejo I, denominado NADH Ubiquinona Oxidoreductasa, y el complejo III, denominado: Ubiquinol-Citocromo-C-Oxidoreductasa.

La produccion de O2- por el complejo I

De las 43 subunidades proteicas que componen el complejo I, 36 son codificadas por el ADN nuclear y 7 por el ADN mitocondrial. Las semi-quinonas generadas en sitios dentro del complejo I, se suponen próximas a los sitios de inhibición identificados dentro del complejo, para los inhibidores análogos a la quinona, rotenona y piericidina.
La afinidad del complejo I por los análogos de la rotenona, demostró que la subunidad PSST (20Kd) es probablemente un sitio de generación de semi-quinona, y por lo tanto de producción de O2-, al igual que la subunidad de 49 Kd.
Se han descubierto 2 especies distintas de semi-quinonas denominadas SQnr y SQns presentes en el complejo I. Se piensa que al menos una de ellas esta asociada a la subunidad TYKY (23 Kd) o PSST (20 Kd).
La Piericidina y otros inhibidores del complejo I aumentan la producción de O2- y H2O2 por la mitocondria en este complejo. Es muy probable que esto ocurra evitando que la semi-quinona done un e- al FeS contenido en una subunidad proteica aceptora.

La producción de O2- por el complejo III

El ubiquinol producido por los complejos I y II es oxidado por el complejo III. Los e- son transferidos mediante reacciones con citocromo B, la proteina con FeS de Rieske y el citocromo C1 al aceptor movil de e- citocromo C.
Bloqueando el pasaje de e- desde citocromo B, con antimicina, se evita que la semiquinona en el sitio Qn cercano a la matriz mitocondrial done ese e- produciendo un marcado aumento en la produccion de O2- por el complejo III.
La mayoria del O2- producido por la cadena respiratoria, bajo condiciones fisiológicas, es generado en la zona de la membrana adyacente a la matriz. Esto también se evidencia por la presencia de niveles apreciables de la SOD I en la matriz mitocondrial, y los relativos bajos niveles de produccion de O2- cuando la mitocondria posee la SOD mitocondrial mientras respira.

La generación de ROS por mitocondria puede ser dañina
Se ha demostrado que el O2- causa daño en los centros FeS. La isoenzima citosólica de la Aconitasa, despues de haber sido expuesta al O2-, es inducida a liberar iones ferrosos; y la enzima desactivada se transforma en una proteina codificante de ferritina mediante ARNm, prolongando su vida media y asegurando un aumento en la sintesis de ferritina para la captacion del Fe libre.
Cuando el O2- producido en mitocondrias no es removido por mecanismos normales (SOD mitoc. deficiente) los daños a los centros FeS de las enzimas como la aconitasa mitocondrial, complejo I y succinato dehidrogenasa son mayores. El daño a estas enzimas por el O2- produce una eventual disminución de ATP mitocondrial y eleva la producción de Acido Láctico, pudiendo desarrollarse en estos casos, acidosis láctica, cardiomiopatias y degeneración de los ganglios basales. Sintomas similares fueron observados en personas con defecto de la cadena respiratoria.
Ratones con falta de SOD I y III desarrollan una axonopatía neuronal pero no son afectados al nacer, sugiriendo que la presencia de la enzima citosólica es menos critica para la supervivencia.
Mientras esto puede ocurrir por los efectos de la acumulación de Fe en mitocondrias, algunos tejidos muestran una clara deficiencia de enzimas que contienen FeS antes que los depósitos de Fe se observen. Esto se explicaría si los daños a estos centros fuesen producidos por las ROS seguidas de una deposición del Fe.

Produccion de RLO-II y defectos de la cadena respiratoria Humana
Pacientes con trastornos hereditarios de la cadena respiratoria, localizados en el complejo I, muestran un incremento significativo de SOD mitoc., mientras que los pacientes con defectos en los complejos II, III, IV o V, no.
La deficiencia del complejo I exhibe un amplio espectro de fenotipos que varían desde intolerancia al ejercicio, cataratas, retraso en el desarrollo, pudiendo llegar a desarrollar una acidosis láctica infantil fatal. Los pacientes con síntomas mas leves tenían menos probabilidades de presentar una concentración de SOD II por arriba de los niveles basales; mientras que los que poseían defectos mas severos (suelen ser fatales) siempre muestran una concentración elevada de SOD mitocondrial.

RLO-II y APOPTOSIS:
Una gran incógnita se plantea si la producción de RLO-II es central para el proceso apoptótico, es importante solo en algunos tipos de apoptosis, o forma parte solo de un efecto colateral. Esta incógnita se plantea a partir de que la apoptosis puede tomar diferentes rutas según el estímulo.
La muerte celular se lleva a cabo por distintas razones. El simple hecho de remover una célula, que ha sido dañada por mutágenos, hipóxia o toxinas, puede realizarse mediante la activación de un número de diferentes mecanismos de detección del daño celular.
Por otro lado, la muerte celular, que es necesaria para remover celulas autoreactivas del sistema inmune, o es parte del proceso de diseño de un organismo maduro, no es al azar y se lleva a cabo dentro de la biologia del desarrollo de cada especie.
Existe mucha confusión acerca del rol de los RLO-II en la apoptosis, ya que parece que incrementos mayores en las ROS pueden ser detectados en períodos tempranos de la apoptosis causada por la activación de la p53, la liberación de ceramidas, staurosporina y TNF (factor necrosante tumoral) .
Por otro lado, los RLO-II administrados como O2- o H2O2 o como amplificadores de los RLO-II (como el paraquat) pueden ser instigadores de la apoptosis.

La apoptosis es un proceso por medio del cual una serie de proteasas de cisteina se activan gracias a una cascada de reacciones que ocasionan que el ADN nuclear de la célula sea degradado, ocasionando la muerte celular.

Muchos componentes mitocondriales desempeñan un rol esencial en la cascada de reacciones. El evento clave es la liberación inicial de citocromo C desde su sitio en la cara externa de la membrana mitocondrial interna hacia el citosol.
Un número de diferentes estímulos, ocurridos en tandem, parecen llevar a cabo esta liberación, que seria posible (según algunos investigadores), gracias a una permeabilidad transitoria en la membrana mitocondrial interna.
Observaciones en mitocondrias aisladas sugieren que bajo condiciones de escaso ATP, alto Ca citosólico, o alta producción de RLO-II, el translocador del nucleótido adenina (ANT) de la membrana mitocondrial interna, sufre un cambio conformacional que permite la descarga del potencial de membrana mitocondrial y la variación del gradiente de pH. A esta serie de eventos se los denomina como Permeabilidad Transitoria de la Mitocondria (MPT), o Apertura Transitoria del Poro Mitocondrial (MTP).
Mediciones efectuadas en celulas, evidencian una disminucion en estos parámetros mitocondriales durante el inicio de la cascada apoptótica, acompañado por la liberación de citocromo C desde la mitocondria al citosol.
La liberación de citocromo C por la mitocondria puede verse inducida por la adición de los grupos proteicos Bax (Bid, Bad, Bax).
Estas proteinas se activan mediante mecanismos puestos en marcha por el retiro de factores de crecimiento, por sistemas de reconocimiento del daño celular, o por la influencia de ligandos de citoquina.
En sistemas experimentales, Bad y Bax sufren una translocacion desde el citosol a la mitocondria en respuesta a RLO-II u otro estímulo apoptótico.
Los principales eventos de la liberación del citocromo C y el mecanismo de la MPT, aun no estan claramente definidos.
La proteína Bad es desactivada por fosforilacion mediada por las quinasas Akt, y conducida por factores de supervivencia (como el IL-3) para que se puedan ejercer los efectos protectores del Bel-2 y Bel-X.

La presencia o ausencia de factores de crecimiento puede significarle la vida o la muerte a muchos tipos celulares desde el momento en que los receptores de los factores de crecimiento responden a ligandos externos por reclutamiento de las proteinas que contiene dominios SH (similitud compartida) que luego actuan como activadores de la “quinasa fosfoinositide-3 (PI3 K )” las cuales activan las Akt (protein-quinasa-B), una protein-quinasa dependiente de serina/treonina cuyos sustratos son agentes claves en la cascada apoptótica. Los blancos mas importantes de la Akt son CREB, kinasas IkB, proteinas pro-apoptóticas Bad y la caspasa 9.
El efecto neto de la actividad de la Akt es el desmembramiento de los patrones catabólicos, mediante la activacion del CREB y la remoción de los estimulos apoptóticos provistos por las proteinas Bad y la caspasa 9. La fosforilación de IkB libera NEkB al núcleo, donde éste inicia la transcripción de un número de mecanismos de defensa celular, incluyendo la SOD II.
Entonces, ¿qué es lo que las proteinas Bad, Bax y Bid hacen a las mitocondrias para que estas liberen citocromo-C ?
Se les atribuyeron, a estas proteínas, varias habilidades en la formación de poros para explicar su accionar en la liberación de citocromo C; pero aparentemente la presencia del canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC) en la membrana mitocondrial externa, es requerida para este mecanismo de liberación.
La incorporacion de VDAC a liposomas no le confiere permeabilidad al citocromo C. El agregado de Bel-xL restringe la permeabilidad de la sucrosa en estos liposomas con VDAC, pero el Bak o Bax aumenta la permeabilidad a este azúcar y permite el paso de citocromo C a traves de la membrana.
Lo anterior encaja con los ya conocidos efectos celulares que este grupo de proteinas ejercen y con las observaciones que demuestran que levaduras sin VDAC no liberan citocromo C en presencia de las proteinas Bad.
Además, el grosor de los poros VDAC, los cuales estan conectados al translocador del nucleotido de adenina de la membrana interna, pueden tambien encajar con las observaciones del transporte del nucleotido de adenina restringido y el incremento del potencial de membrana visto con el aumento de la expresión del grupo de proteínas Bel-2.
También se sugiere que el Bax podría interactuar directa o indirectamente con el ANT. Se llegó a esta conclusión por el hecho de que levaduras con una expresión nula del ANT están protegidas de la apoptosis inducida por el Bax.

EFECTO “DOMINÓ”:
La liberación de citocromo C puede detonarse gracias a los RLO-II o por un número de estímulos diferentes; pero este es un paso temprano en el proceso de la disolución normal de la célula.
El citocromo C se combina con el factor citosólico Apaf-1, el que luego activa a la caspasa 9. Esta, a su vez, se escinde en caspasa 3 para ser mas activa, y dos eventos resultantes de clivaje proteico conllevan a la escisión del ADN posterior a su condensación.
Además, se incluye la activación del CAD (ADNasa activada por caspasa) mediante la separación de la subunidad inhibidora ICAD, y una segunda activación, por separación, de la ACINUS (Inductor Apoptótico de la Condensación de Cromatina en el Núcleo). Un factor proteico adicional es liberado desde la mitocondria simultaneamente con el citocromo C, el AIF (Factor Iniciador de la Apoptosis), el cual se transloca al núcleo y particípa en la condensación nuclear. Otra proteína mitocondrial la DIABLO tambien es liberada para evitar que las IAP (grupo citosólico de Proteínas Inhibidoras de la Apoptosis) inhiban la activación de la caspasa 3. La influencia que los RLO-II ejercen sobre la liberación de estas proteínas no ha sido investigado a fondo todavía.

El resultado de esta cascada de reacciones es una serie de cambios producidos en la célula en el siguiente orden:

1. Se desarma el citoesqueleto de modo que la célula pierde contacto con sus vecinas, y se vuelve esférica.
2. Se compacta la cromatína y las moléculas de ADN se fragmentan.
3. El citosol y las organelas se condensan.
4. Se fragmenta el núcleo.
5. Aparecen protuciones en la superficie de la célula, integradas por unfragmento nuclear y un sector del citoplasma que lo envuelve.
6. Se desprenden las protuciones (vesículas apoptóticas)
7. Las vesículas son fagocitadas.

RLO-II y la p53:
El sistema de reconocimiento que responde ante el daño celular producido por luz UV, radiaciones, hipoxia y toxinas, implica la interacción de una serie de diferentes elementos pero, no obstante, es parecido a las rutas antes descriptas en el proceso apoptótico.
La p53 es una proteína que responde ante un error o daño en la duplicación del ADN. En ratones con falta de p53 se desarrollan rápidamente sarcomas y linfomas demostrando su importancia en el control celular.
La detección de ADN dañado pone en marcha una serie de eventos mediados por la p53, la cual induce la transcripción de productos intermediarios de estos sucesos, como la proteína p21 inhibidora de ciclinas, que detiene la división celular.
Existe una modificación secundaria de la p53 (mediante la acetilación en residuos de lisinas) mediada por su coactivador, el PML (Supresor Tumoral P300), el que reduce el empaquetamiento del ADN haciéndolo mas predisponible para la transcripción.
Existe una Deacilasa, denominada MTA2, que remueve esta activación, y por lo tanto hace que la p53 sea menos hábil para responder a los estímulos (daño celular).
La SIR2 es una Deacilasa Histónica dependiente de NAD que, cuando es deficiente en levaduras y en condiciones nutricionales determinadas, acorta la vida (y puede afectar también a la p53 acilada).
La p53 también es fosforilada por quinasas, como las ATM en respuesta al daño del ADN por UV o radiaciones, reduciendo nuevamente su capacidad de inducir la transcripción.
Se producen varias transcripciones, o “transcriptos”, en respuesta a la activación de la p53, siendo uno de ellos el Bax; el aumento de la relación Bax/Bel-2 predispone a la célula a sucumbir a la apoptosis.
El transcripto segundo en importancia, es la PIG3, una Oxidoreductasa que parece ser responsable, al menos en parte, del aumento en la producción de RLO-II en mitocondria.
Además, parece que existe una activación de Caspasa 8 dependiente de p53; lo que implica un posible rol en el clivaje de la Bid en el mecanismo de inducción de la apoptosis mediado por la p53.

Por lo tanto, existen varios mecanismos que convergen en que la apoptosis es una respuesta a una señal de la p53.

Un estudio reciente demostró que la proteína p66slic, la cual es un transductor de señales de crecimiento como la PDGE, puede ser directamente fosforilada en respuesta al H2O2 en la serina 36, demostrando una regulación positiva de la p53.
Esta regulación positiva permite la inducción del inhibidor de ciclinas p21, que detiene el crecimiento y posibilita la muerte celular después de haber estado expuesta, la célula, a UV o H2O2.

PRODUCCION DE RLO-II Y PROTEINAS DESACOPLANTES:
Las proteínas desacoplantes UCP1, 2,3 y 4, son proteínas mitocondriales que funcionan como vectores que crean un cortocircuito en el transporte de H+, generando calor y pérdida de energía. Se demostró que la UCP1 requiere de un ácido graso para activarse y es inhibída por bases púricas. Se cree que todas las UCP actúan de manera similar.
Altos niveles de UCP producen un colapso en el potencial de membrána mitocondrial, lo que reduce la generación endógena de Ubisemiquinona en la cadena respiratoria, lo que a su vez conlleva a una baja tasa de producción de O2-.
De todos modos, un reciente descubrimiento muestra que la quinona es necesaria para la actividad de las UCP, y podría ser que la generación de RLO-II esté, de alguna forma, mas ligada con la función de las UCP.